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利用離心機對酵母核糖核酸進行分離和鑒定

2022/3/29 22:03:50??????點擊:
一、 實驗目的

1、掌握酵母RNA提取的方法。

2、了解核酸的組成。

3、掌握鑒定核酸組分的方法和操作。

二、 實驗原理

酵母核酸中RNA含量較多,DNA則少于2%。RNA可溶于堿性溶液,當堿被中和后,可加乙醇使其沉淀,由此即可得到RNA制品。但是用堿液提取的RNA有不同的降解。RNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸等組分,加入硫酸煮沸可使其水解,從水解液中可以測出上述組分的存在(見實驗內容)

三、 實驗步驟

1、 用托盤天平稱1g干酵母于研缽中,加入少許石英砂,再加入2ml 0.04mol/LNaOH溶液,在研缽中充分研磨至少5min。

2、 再加4ml 0.04mol/LNaOH溶液于勻漿液中,混勻后,將勻漿液轉移到大試管中,再用4ml 0.04mol/LNaOH溶液洗滌研缽,洗滌液并入勻漿液中。

3、 將大試管小心在沸水浴中加熱30min,冷卻后倒入離心管中,與另一組離心管在托盤天平上平衡,然后兩組的離心管對稱地放入離心機中,2000r/min下離心15min。

4、 吸取10ml酸性乙醇溶液于小燒杯中,將離心管上清液小心倒入小燒杯中,邊倒入邊攪拌,直到RNA沉淀完全。

5、 將小燒杯中的液體倒入2個干凈的離心管,平衡、離心(2000r/min)3min。

6、 棄去兩離心管上清液,各離心管中加入95%乙醇2.5ml,振蕩、混勻、平衡、離心(2000r/min)3min。

7、 棄去兩離心管上清液,各離心管加入3ml 1.5mol/L硫酸,混勻、倒入同一個大試管中,貼上標簽,放在試管架上,備用。

8、 將水解液在沸水浴中加熱至少10min,使沉淀RNA充分水解。

9、 取一支試管A,加入1ml 0.1mol/L硝酸銀溶液,再逐滴加入濃氨水至沉淀消失,然后加入1ml水解液放置片刻,觀察有無白色嘌呤堿的銀化合物沉淀。

10、 另取一支試管B,加入水解液1ml,三氯化鐵濃鹽酸溶液2ml和地衣酚乙醇溶液0.2ml(約4滴),混勻,用試管夾夾好后放到沸水浴中3~5min,注意觀察溶液是否變成綠色,說明核糖的存在。

11、 再取一支試管C,加入水解液1ml和定磷試劑1ml,混勻,在沸水浴中加熱,注意觀察溶液顏色的變化,溶液變藍,說明磷酸存在。

注意事項:離心管一定要平衡對稱放入離心機中,離心機達到設置轉速時才能離開。


四、 實驗結果

第6步中離心管底部有不少的RNA沉淀。

試管A:出現白色渾濁現象。有嘌呤堿存在。

試管B:加熱后,出現鮮綠色,且隨著加熱時間延長,顏色越來越深。有核糖存在。

試管C:加熱后,出現藍色,且隨著加熱時間延長,顏色越來越深。有磷酸存在。

說明RNA的組分中有嘌呤堿、核糖、磷酸。

分析:

本實驗選用酵母,是因為酵母中RNA含量較多,且價格便宜。RNA可溶于堿性溶液,所以本實驗用0.04mol/LNaOH溶液來提取。RNA不溶于乙醇,可用酸性乙醇使RNA從溶液中沉淀出來,再用乙醇洗滌沉淀,可得到RNA粗制品。

研磨和NaOH使酵母細胞破裂,RNA主要存在于細胞質中,所以RNA被釋放出來,同時,NaOH使蛋白質變性。

加入酸性乙醇,一方面可以中和NaOH,另一方面,使RNA從溶液中沉淀下來。

RNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸等組分,加入硫酸煮沸可使其水解,從水解液中可以測出上述組分的存在。

(1)強酸使核酸分子的有機磷消化為無機磷,使之與鉬酸銨結合成磷鉬酸銨(黃色沉淀)
PO43- + 3NH4+ + 12MoO42- + 24H+ ===(NH4)3PO4.12MoO3.6H2O + 6H2O

當有還原劑(如維生素C)存在時,Mo6+被還原成Mo4+,再與試劑中的其它MoO42-結合成Mo(MoO4)2,呈藍色,稱鉬藍。所以試管C中會出現藍色。

(2)RNA與硫酸共熱,生成的核糖進而脫水轉化為糠醛,三氯化鐵作為催化劑,可與地衣酚反應,生成綠色化合物,所以試管B中出現綠色。(OR苔黑酚)

(3)嘌呤堿可與硝酸銀反應產生白色的飄零銀化合物沉淀。所以試管A中出現渾濁現象。

(4)不檢測嘧啶堿,是因為與嘌呤堿相比,它難以被水解下來,同時它難檢測且現象不明顯。

擴展資料:

酵母核酸提取原理

提取和制備RNA 的首要問題是選RNA 含量高的材料。微生物是工業上大量生產核酸的原料,其中RNA 的提制以酵母最為理想,因為酵母核酸中主要是RNA(2.67~10.0%),DNA 很少(0.03~0.516%),而且菌體容易收集,RNA 也易于分離。

RNA 提制過程首先要使RNA 從細胞中釋放,并使它和蛋白質分離,然后將菌體除去。再根據核酸在等電點時溶解度最小的性質,將pH 調至2.0~2.5,使RNA 沉淀,進行離心收集。然后運用RNA 不溶于有機溶劑乙醇的特性,以乙醇洗滌RNA 沉淀。

提取RNA 的方法很多,在工業生產上常用的是稀堿法和濃鹽法。濃鹽法是在加熱的條件下,利用高濃度的鹽改變細胞膜的透性,使RNA 釋放出來,此法易掌握,產品顏色較好。

使用濃鹽法提出RNA 時應注意掌握溫度,避免在20~70℃之間停留時間過長,因為這是磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍,會使RNA 因降解而降低提取率。在90~100℃條件下加熱可使蛋白質變性,破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯酶,有利于RNA 的提取。
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