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奶及奶制品中黃曲霉素M1的乳脂離心機檢測

2016/6/12 23:09:09??????點擊:

   黃曲霉毒素主要存在于谷物、堅果、花生、棉籽粉、玉米、干辣椒粉等食品中以及一些與人類血液,動物飼料相關的產品中。霉菌的生長并不一定表明黃曲毒素的存在,因為黃曲毒素只有在濕度、溫度適合及通風良好才會生成。黃曲霉素B類具有藍色熒光,G類具有綠色熒光。除了蔬菜中常見的(B1,B2,G1,G2),還有存在喂食了有毒飼料的奶牛的牛奶中的黃曲霉素M,其中毒性最高的M的代謝物為4-羥基化的產物Bs.黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1的羥基化代謝產物,也是一種強致癌物質。其危害巨大,人類日常消費食品中如牛乳及其制品是易受到黃曲霉毒素M1污染的食品之一。黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用,嚴重時,可導致肝癌甚至死亡。毒性是砒霜的100倍其實主要是指黃曲霉毒素比砒霜毒。
 
 目前來講,Aflatoxin M1的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC),酶聯免疫檢測法等。液相色譜法可以精確的檢測奶制品中黃曲霉毒素的微小含量。而使用黃曲霉毒素M1 ELISA試劑盒則能夠快速而準確的分析樣品中黃曲霉毒素M1殘留。

高效液相色譜法:根據國標《GB 5413.37—2010》食品安全國家標準乳和乳制品中黃曲霉毒素M1 的測定 

實驗用前處理:實驗儀器和好耗材包括:恒溫水浴鍋  溶劑過濾器(帶真空泵)1000ml  高速勻質器 黃曲霉毒素免疫M1親和柱玻璃纖維濾紙 玻璃注射器 無熒光特性玻璃試管 空氣壓力泵 超聲波清洗機  定量濾紙 量筒 樣品瓶 容量瓶 移液器或移液管

實驗用試劑:色譜乙腈 色譜甲醇 氫氧化鈉 石油醚 超純水或去離子水等等

HPLC條件: 高效液相色譜儀   色譜柱 C18柱,150*4.6mm,5um 流動相 乙腈-水(25:75) 熒光檢測器: 激發波長365nm,發射波長435nm; 柱  溫 室溫 流速 1.0ml/min 進樣量 20ul 出峰時間 10分鐘左右  

樣品取樣:真菌毒素分析的最大誤差來源是樣品的收集和取樣過程,所以必需保證樣品收集和取樣具有代表性。

樣品前處理:不同樣品
 牛奶  水浴加熱至40度,離心用上清液過柱凈化;
 乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品:稱取適量奶粉樣品,用于蒸餾水中,混合均勻使其充分溶解,離心離心用上清液過柱凈化;
 發酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型):稱取適量奶粉樣品,用于蒸餾水中,調節PH值至微堿性,高速均質器勻漿,水浴加熱后離心,取上清液混合均勻使其充分溶解,離心離心用上清液過柱凈化;
 干酪:稱取適量切細或粉碎,過篩用加純水溶解,高速均質器勻漿,超聲提取后收集上清液,然后用石油醚進行兩次萃取,然后用適宜的有機溶液萃取,取若干上清液過柱凈化
 奶粉樣品,用于蒸餾水溶解中,調節PH值至微堿性,水浴加熱后離心,取上清液混合均勻使其充分溶解,離心離心用上清液過柱凈化;
 奶油:稱取適量加甲醇水溶解,震蕩后分液漏斗取下層溶液,蒸干后溶于水用于過柱凈化。
 
免疫柱凈化步驟:完全符合GB/T 18980-2003
1、取出免疫親和層析柱, 恢復至室溫,將上方塞子取出斜剪斷,再插回親和柱上。
2、將免疫親和柱連接于玻璃注射器下。準確移取清澈液注入玻璃注射器;
3、將空氣壓力泵與玻璃注射器連接,調節壓力使溶液以約2-3mL/min流速緩慢通過免疫親和柱,直至2~3mL空氣通過柱體;
4、更換玻璃注射器與親和柱連接,在注射器中加入10ml水,調節壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱。
5、準確加入4mL色譜級乙腈洗脫,流速為1 mL/min ~2mL/min,收集全部洗脫液于玻璃試管中,供檢測。

注:收集管中的洗脫液即為純化后的樣品,可直接用ELISA,熒光和高效液相等方法檢測。 HPLC 檢測需要儀器與耗材 產品名稱 說明 黃曲霉毒素M1固體標準品 參比對照使用 黃曲霉毒素M1液體標準品 濃度0.5ug/ml, 溶于乙腈 PriboFast 黃曲霉素M1免疫親和柱 用于 樣品前處理柱 分析黃曲霉素 PriboFast泵流操作架(8位) 用于免疫親和柱凈化樣品處理,方便控制流速 黃曲霉毒素檢測專用玻璃纖維濾紙 用于去除HPLC檢測時部分雜峰,有效提高靈敏度。110,1.5um 不銹鋼均質器  高速勻漿樣品,有效提高萃取效率 旋轉蒸發儀-超聲波發生器等配套設備

     酶聯免疫檢測法:符合國家標準酶聯免疫檢測法采用競爭ELISA,在微孔板上預包被黃曲霉毒素B1抗原,加入樣本(或黃曲霉毒素M1標準品溶液)及辣根過氧化物酶標記的黃曲霉毒素M1抗體。樣本或標準品溶液中的黃曲霉毒素M1與預包被在板孔上的黃曲霉毒素M1抗原競爭結合辣根過氧化物酶標記的黃曲霉毒素M1抗體。未結合的酶標抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液,讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素M1抗原的含量成負相關。對照標準曲線,即可得出相應殘留物黃曲霉毒素M1的含量。

樣品處理牛奶 直接離心取上清液用于檢測奶粉及其他固狀奶制品:需要溶解于去離子水中,乳脂離心機離心取上清液用于檢測試劑盒檢測時間:30分鐘+30分鐘交叉反應率: Aflatoxin M1 100% Aflatoxin B1 8% Aflatoxin B2 10% Aflatoxin G1 7% Aflatoxin G2 5% ELISA 方法檢測需要:   說明 PriboFast 黃曲霉毒素M1酶聯免疫檢測試劑盒 96T 檢測范圍 (0.1 ppb -8.1ppb) 移液器(彩色) 多個量程:0.5-10; 20-200; 5-50; 1000-5000ul 八道半支滅菌移液器 量程: 5-50ul; 50-300ul 酶標儀等 進口、國產儀器, PriboFast試劑盒采用直接競爭法,檢測時間短,步驟簡單,性能穩定,檢測限符合國標要求。

對分析人員要求:化學分析儀器及其相關專業或有高效液相色譜儀操作經驗的人員均可很快掌握黃曲霉毒素M1檢測技術。

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