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利用高速冷凍離心機分離大鼠肝臟中的細胞核基質

2022/3/28 23:12:51??????點擊:
     核基質是指真核細胞間核中除核被膜、染色體和核仁以外的一個精密網架系統,既包含蛋白質,又包含RNA。核基質是從純化的細胞核中利用高速冷凍離心機分離的。要用去污劑、核酸酸處理細胞核。以分離核基質的每一步中抑制核酸酶的活性非常重要。 

     本文介紹1986年Comerford使用過的分離細胞核基質的方法和步驟。 

     1. 大鼠肝臟(50~100g)剪碎,加3倍體積的10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4,4℃)。勻漿后通過幾層紗布過濾,在4℃,勻漿液以800gmax(用的是MSE Chilspin離心機,4*100ml轉子,2100r/min)離心10分鐘。把沉淀重新懸浮在勻漿緩沖液里,該緩沖液包含56%(質量濃度)蔗糖,再在4℃以60000gmax(用Sorvall OTD50超速離心機,A641轉子,28000r/min)離心90分鐘。把沉淀用20mL勻漿緩沖液洗兩次。 

     2. 把細胞核沉淀重新懸浮在20mL STEM緩沖液中[STEM:50mmol/L Tris-HCl,50mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EGTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4,4℃)],加入四硫酸鈉,終濃度為0.2mmol/L。在4℃孵育后,加入N-乙酰馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide,NEM),終濃度為5mmol/L。 

     3. 在800 gmax離心沉淀細胞核,并用20mL STEM洗三次,把細胞核重新懸浮在20ml STEM中,補加20μg/mL DNase I(Boehringer, grade I),在37℃孵育20分鐘,再在800 gmax離心回收沉淀。 

     4. 把沉淀懸浮在20mL LS緩沖液里[LS緩沖液:10mmol/L Tris-HCl,0.2mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、10mmol/L PMSF(PH=7.4,4℃)] ,在4℃孵育10分鐘, 再在800 gmax離心10分鐘回收沉淀。 

     5. 把沉淀重新懸浮在1mL 含有70%(質量濃度)蔗糖的LS緩沖液里。上面鋪放3層蔗糖梯度,各2ml 60%,50%和40%(質量濃度)蔗糖(用含2mol/L NaCl的LS緩沖液配制蔗糖溶液)。在800 gmax離心1小時,細胞核基質在40%和50%蔗糖分離界面?;厥蘸笥肧TEM緩沖液(10ml)洗一次。 

      該方法可用于各種類型細胞核基質的分離, 如果其它相關問題,歡迎在線交流咨詢,上海趙迪銷售實驗室離心機,高速離心機,低速離心機,冷凍離心機及耗材,產品質量實現三包承諾,質保一年,終身保修,價格公道,信譽保證!

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